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糞便樣本Meta核酸抽提小秘密

版權所有,轉載請聯系基因市場部
2019-09-11

        核酸提取是分子類相關實驗的第一步,核酸抽提質量的好壞直接關系到后續實驗是否能夠順利進行。常規樣品的核酸提取已經不是困擾實驗者們的痛疾,讓實驗者們煩惱的多是一些特殊樣本的核酸提取工作,比如糞便。


糞便樣本是一類具有挑戰性的樣本。

挑戰

1

不同來源的糞便組份差別較大,是否需要樣本前期處理?

        比如雜食動物的糞便如人、犬糞便,里面含有相對較高的水份并且粘性大;食草動物的糞便如兔子、羊糞便,含水量相對較少、富含纖維;干燥堅硬的糞便如老鼠的糞便,含水量極少。不同來源的糞便,含有的成份不同,樣品的前期處理也不盡相同,比如裂解的用量,是否水浴加熱等。

挑戰

2

每份糞便樣本中含有復雜的成份,如何有效的去除這些物質?

       糞便中包含食物殘渣、脂類、多糖、蛋白、膽鹽和PCR抑制因子等成份。有些成份比如蛋白、PCR抑制劑處理不當會隨著提取過程進入核酸,造成核酸的純度非常差,影響到下游的應用。


        今天小編就給您說道一下,糞便核酸提取過程中的注意事項。以提取糞便里面的DNA為例。


糞便樣本DNA抽提流程基本包括如下的步驟:

我們的說道也就從這幾個環節說起。


樣品準備

       動物的糞便相比人的糞便,含水量較少,建議降低樣本的上樣量。

       小鼠、兔子的糞便甚是干燥,容易吸收裂解液,導致離心后上清體積不足,所以建議上樣量降低或者增加裂解液用量。

        人的糞便也受到飲食習慣、身體狀態的影響而有很大不同。一些高糖高脂飲食習慣的人群,糞便樣本中的脂類含量很高,這樣的樣本會影響提取時的裂解效率,建議減少起始原料可以提高樣品的裂解效率和核酸的純度。

        此外如果人的糞便中含有未消化的食物,比如:糧食和水果外殼、未消化的種子等,請務必剔除出樣本。


樣本裂解

       欲得到高產出并且無污染的DNA,樣本裂解非常的重要。

       含水量較低的糞便樣本,除了上樣量降低外,建議加入裂解液等比例的實驗級水,防止樣本的吸水,導致裂解上清過少。裂解液加入后搖晃2-3s 充分混均,短時加熱(比如70℃),可以讓樣本裂解和組份溶解的更充分。食草動物比如:兔子、羊,無需樣本加熱,直接進行后續的組織勻漿。

       組織勻漿步驟離開不了物理破碎過程,比如機械碾磨珠。

       化學裂解液加上碾磨珠機械破碎,宿主和細菌細胞全被破碎。即使是干燥的固體糞便比如小鼠糞便,經過10min vortex處理也會破碎的非常完美。當然,破碎的條件需要根據自己的樣本情況來適當的微調。目前已發現,陶瓷珠結合 Bead Tube Holder 在Vortex-Genie? 勻漿效果最好。


裂解液澄清

       離心是裂解液澄清最常用的也是最傳統的做法。對于糞便樣本來說,這樣處理是不足以去掉糞便中復雜組份的。

       最好是在離心后的澄清裂解液中加入污染物沉降劑,然后在低溫下比如2-8℃孵育一會,再次離心。

       這樣就足夠了嗎?以上做法只是沉降了蛋白、殘渣等物質,樣本中的抑制組份還是需要專門的抑制劑去除柱Inhibitor Removal Column。


洗滌

       洗滌可以去除結合在柱膜上的多余的污染物。

       一般進行四部洗滌,結合液洗滌、高鹽洗滌(胍鹽)、低鹽洗滌兩次。建議第三次洗滌時,vortex 一小會,以便洗滌下來管體管蓋上的胍鹽。胍鹽230nm 有吸收峰,胍鹽去除不當會影響A260/A230比值。


洗脫

       洗脫時注意將洗脫液滴入柱膜的中心并且孵育1min,可以增加回收率。

       回溶洗脫液可以得到更高濃度的核酸。


以上是提供給大家的土壤DNA抽提的注意事項。

如果您試驗中有積累下來的小經驗歡迎聯系我們。


為了答謝大家對基因有限公司的關注,現有糞便、土壤樣本DNA、RNA核酸抽提產品雙福利!

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